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淺析無菌實驗室的要求與日常管理
雙擊自動滾屏 發布者:admin 發布時間:2013-08-22 10:06:50 閱讀:715次 【字體:

一、 實驗室設施
開展無菌檢查及微生物限度檢查工作,首先要按照《藥品檢驗所實驗室質量管理規範》及《藥品生產質量管理規範》的要求,建立一個布局合理、使用方便、操作安全的無菌室,並且配有完善的實驗設施和管理製度。無菌檢查、微生物限度檢查以及接種室(接種對照菌、菌種傳代)均應嚴格分開,具有危險性的毒株、毒素如破傷風梭菌、黃曲黴毒素的實驗室需單獨使用,以便控製防止傳播。
(一)  潔淨實驗室
1.潔淨室的布局
1.1根據樣品檢驗要求,一般應至少包括更衣緩衝係統、微生物限度檢查室、無菌檢查室、陽性菌室和物流通道。
1.2更衣係統應至少包括一更(含更鞋)、二更(含洗手)、緩衝以及人流走廊等。
1.3物流通道應考慮淨汙分流的布局,有條件的可設置汙物走廊
2.潔淨室的設計要求
2.1淨化級別:潔淨走廊、檢查室、陽性菌室應為一萬級;其他房間應為十萬級
2.2氣流組織:陽性菌室對走廊呈負壓,走廊對緩衝有5Pa的正壓;陽性菌室全排風
2.3電氣控製:控製開關外置;設置通訊係統
3.結構與要求:
無菌潔淨室不宜設在底層,防潮、防黴、采光好,遠離交通幹道,廁所及汙染區,麵積不超過10m2,高度不超過2.4m,由兩個緩衝間、操作間組成。操作間緩衝間之間應有樣品傳遞窗,出入操作間和緩衝間的門不應直對。無菌室內應六麵光滑平整,無縫隙,不起灰,不落塵,耐腐蝕,易清洗,牆壁與地麵、牆壁與天花板連接處應呈凹弧形,操作間不得安裝下水道。
無菌室內的照明燈應嵌裝在天花板內,采光麵積要大,光照應分布均勻,光照度不低於300勒克斯。緩衝間和操作間應裝有紫外線殺菌燈(2-25w/m3)''用於空氣消毒。紫外線波長200-300nm者具有殺菌作用,其中以265-266nm殺菌作用最強,這與DNA的吸收光譜範圍一致,其殺菌機理可能是在細菌細胞DNA中引起胸腺嘧啶雙聚體形成,從而幹擾細菌細胞DNA複製,導致細菌變異死亡。紫外線殺菌燈1m以內距離殺菌效果最佳,每次開燈照射時間為30min。應定期檢查紫外線燈輻射強度,不得低於70μW•cm-21m距離。其缺點是穿透力弱,一張紙板可以阻礙光的透過,不能穿透固體物,故隻能用作表麵消毒及一些不耐熱或化學消毒劑物品的消毒。
4.溫度、濕度
無菌室內溫度和相對濕度直接影響紫外殺菌燈的殺菌效果,故溫度最好控製在25±2℃,相對濕度40-60%。操作間或淨化工作台的潔淨空氣應保持對環境形成正壓,不低於49Pa。
5.操作間
無菌室內應安裝空氣除菌過濾層流裝置及調溫裝置。潔淨度要求:淨化工作台潔淨度為100級,無菌室應為10000級。
操作間應準備乙醇燈(或煤氣燈),火柴,2%碘酊棉球及75%乙醇棉球、試管架、大小橡皮乳頭、砂輪、記號筆、無菌剪刀、鑷子、注射器等。微生物限度檢查無菌室操作間內還應有電子稱(感覺為0.1g,最大稱量為300g為宜),電動勻漿儀等。
6.緩衝間
緩衝間內應有洗手盆,消毒液,無菌衣,帽,口罩,拖鞋等,緩衝間內不應放置培養箱和其他雜物。
(二)潔淨室的使用
1.在實驗開始之前1小時啟動風機係統(空調係統),並開啟空氣消毒裝置,消毒至少半小時後關閉
2.觀察並確保潔淨室的壓差
3.物品經物流通道進入潔淨室
4.人員正確著裝後經人流通道進入潔淨室
5.使用完畢,應用消毒液清潔工作台麵。實驗人員在更衣室換下無菌工作衣後出潔淨工作室。開啟空氣消毒裝置,消毒至少半小時後,關閉潔淨工作室的控製開關。
(三)潔淨室的清潔維護
1.潔淨室的清潔維護分為日常維護、定期維護和不符合時的維護。
2.日常維護由每次實驗的實驗人員進行,維護的範圍為進行實驗的潔淨工作室和輔助潔淨區,維護的頻率為每次實驗後。
3.定期維護由實驗室指定專人進行,維護的範圍為所有潔淨工作室,維護的頻率為每二周一次。
4.不符合時的維護由實驗人員進行,維護的範圍為所有不符合的潔淨室,維護的時機為出現不符合時
(四)  潔淨室的驗證
1.驗證的項目:潔淨度、微生物數、換氣次數、靜壓差、照度、溫度、相對濕度
2.驗證的技術要求
驗證項目   十萬級 一萬級 一百級
溫度(℃) 18-26  20-24  20-24
相對濕度(%) 45-65  45-60  45-60
換氣次數(次/h)  不小於15  不小於25  -
壓差(pa) 相對室外:10     有級差的潔淨室之間:5
照度(Lx) 主要工作室≥300   輔助工作室≥150
懸浮粒子數(粒/m3)  ≥0.5um    3500000    350000 3500
    ≥5um  20000  2000   0
浮遊菌數(個/ m3)   500 100 5
沉降菌(個/皿)   10  3   1
3.驗證的周期  建議每半年一次,也可根據潔淨室的使用頻率適當增加驗證次數。
4.驗證的方法  潔淨度和微生物數:采用GB/T16292~16294-1996,其他項目:參照JGJ71-90。
5.驗證不符合項的處理
5.1當潔淨度、微生物數、換氣次數、靜壓差等指標出現不符合時,應停用潔淨室,對淨化係統進行調整後,在重新驗證,直至符合規定才能重新啟用潔淨室。
5.2當溫度、相對濕度和照度等指標出現不符合時,潔淨室可不必停用,但應及時修複空調係統(或更換照明裝置),使其符合規定。
二、實驗室管理:
為保證實驗工作有序進行,實驗室必須製定一係列實驗室管理製度。
(一) 實驗室要求:
1實驗室環境應清潔、衛生、安靜,實驗室內嚴禁吸煙和飲食。
2實驗人員必須穿戴工作衣帽,工作服經常洗滌、消毒、保持清潔。
3操作前後或離開實驗室必須用肥皂或消毒液洗手。
4發生菌液汙染台麵或地麵,應立即用3%甲醛或5%碳酸等消毒液由外向內傾覆其上,1小時後再擦拭,如為破傷風梭菌,則應隔夜後再擦洗。
5工作衣、帽、口罩受到菌液汙染時,應立即脫下使汙染部位包裹在內部,高壓滅菌後再清洗。
6如有傳染性培養物汙染手部,應先用75%乙醇棉球擦拭,再浸入0.1%新潔爾滅消毒液內泡手,然後再用肥皂及清水徹底洗幹淨。
7接種環(針),每次使用前後,必須通過火焰滅菌,冷卻後方可接種培養物,接種帶有蠟質、油質的培養物或菌苔殘留多時,不應立即在火焰上灼燒,應先在內焰裏將油質培養物烘幹後再移至火焰上滅菌,以免活菌外濺汙染環境及感染操作者。
8帶菌的吸管應浸泡在5%甲酚消毒液內24h後取出清洗,帶菌的試管或培養物應在121℃高壓滅菌30分鍾後再取出清洗。
9在接種黴菌、放線菌時應在鋪有浸過消毒液的紗布上操作,防止孢子散落傳播。
10廢棄物的處理:
a)         必須消除生物危害後,才能處理,一般使用高壓蒸汽滅菌,也可以采用直接焚燒。
b)        汙染性銳器(如一次性針頭)應滅菌後處理,注意避免銳器紮傷。
c)         汙染性可重複使用的材料(如平皿)應滅菌後清洗,宜使用不易破碎的材料。
d)        工作服(含潔淨工作服)應定期清洗,懷疑汙染的工作服應滅菌後清洗,潔淨工作服應滅菌後使用。
(二) 無菌操作要求:
無菌操作是指在無菌的環境條件下,使用無菌器材,防止微生物汙染的操作技術。即保持待檢樣品在操作時不被汙染,又要防止被檢的微生物及陽性對照菌在操作中汙染環境或感染操作人員。從事無菌及微生物操作的工作人員必須經過無菌技術及基礎微生物學專業知識的學習及培訓才具備上崗操作的資格,微生物專業檢驗人員也不應該頻繁地變換工作崗位。
1.無菌室應每次使用前後用0.1%苯紮溴銨溶液或2%甲醛液擦拭工作台麵及可能汙染的死角,濕拖地麵,打開無菌空氣過濾器及超淨工作台的開關30分鍾,紫外線殺菌燈照射1小時。
2.操作人員用肥皂洗手後進入緩衝間換拖鞋,用75%乙醇棉球擦手,穿戴工作衣帽、口罩。將所需物品剝去牛皮紙及外包裝,從傳遞窗移入操作間,再用0.1%苯紮溴銨溶液泡手後進入操作間,在乙醇(或煤氣燈)火焰區(火焰高度3-5cm)操作。
3供試品表麵消毒,如為安瓿先用砂輪劃痕後用2%碘酒棉球擦拭,再用75%乙醇棉球擦拭、待幹,也可以用消毒液浸泡消毒。
4操作者勿用嘴直接吸吹吸管,防止致病菌感染操作人員及口中的雜菌汙染供試品。
5在無菌操作中切勿大幅度或快速動作、拖行,以免攪動空氣中塵埃微粒。
6注射器如需回抽時,應對著火焰吸入無菌空氣。
7所用的器材如培養基、稀釋劑配製後經濕熱滅菌121℃30分鍾,吸管培養皿等均應洗滌,幹燥,包紮後經幹熱滅菌160℃2小時才能使用。
三、消毒劑的質量控製
(一)消毒劑安全使用原則
1.正確選擇消毒劑的種類,盡可能選擇低毒、低殘留的消毒劑。
2.正確選擇使用濃度,確保消毒效果。
3.正確選擇消毒方式,可以浸泡、擦拭或噴霧。
4嚴格掌握消毒時間。
5.定期更換,避免產生耐藥性。
6.不聯用和混合使用。
7消毒前,應進行清潔。
(二)消毒劑的種類
1.高效消毒劑(HLD):能殺滅一切微生物(包括芽孢),常見的有過氧乙酸、甲醛、環氧乙烷和含氯消毒劑
2.中效消毒劑(ILD):能殺滅抵抗力較強的結核杆菌和其他細菌、真菌和大多數病毒,常見的有乙醇、苯紮溴銨、碘酊和甲酚皂溶液等
3.低效消毒劑(LLD):能殺滅除結核杆菌以外的抵抗力較弱的細菌以及抵抗力較弱的真菌(如念珠菌)和病毒(如流感病毒、艾滋病毒等),常見的有氯已定、三氯散和高錳酸鉀等
(三)  消毒劑配製
1.根據消毒劑使用區域和對象的不同,將消毒劑分成3類,分別是:
第一類消毒劑,專用於普通實驗區,僅用於物品外表麵的消毒,常用的有聚維酮碘和石炭酸等;
第二類消毒劑,專用於潔淨室的更衣室,僅用於佩戴手套的雙手消毒,常用的有苯紮溴銨和75%乙醇;
第三類消毒劑,專用於無菌操作間,直接用於消毒直接接觸藥品的容器表麵,也用於實驗操作過程中的手部消毒和實驗台麵消毒,常用的有聚維酮碘溶液和75%乙醇。
2.配製
第一類消毒劑的配製方法:不需使用無菌器具,可直接在普通實驗區按消毒劑使用說明書的配製方法,用純化水稀釋消毒劑的濃溶液後使用。
第二類消毒劑的配製方法:不需使用無菌器具,應在更衣室內按消毒劑使用說明書的配製方法,用純化水稀釋消毒劑的濃溶液後使用。
第三類消毒劑的配製方法:需要使用無菌器具並在無菌操作間內配製。首先取一次性集菌過濾器一個,將排液口放置在滅菌過的錐形瓶上,將消毒劑濃溶液通過薄膜過濾的方式除菌。然後,按比例取滅菌後的純化水,稀釋濃溶液,製成可供使用的消毒劑。將此消毒劑倒入放置有無菌脫脂棉球的消毒劑缸中,得到可直接使用的消毒劑棉球。(該類消毒劑製備後,應收集消毒劑中的微生物)
四、環境監控
(一)目的:
確定工作台麵、設備表麵的消毒效果和消毒頻次,確定潔淨室的綜合性能以及進行維護的時機,確定培養箱的汙染情況,判斷是否有必要進行徹底消毒。
(二)環境監控的對象
1.樣品貯存的環境
2.培養基製備的環境
3.樣品製備和檢驗的環境
4.培養的環境
(三)環境監控的方法
1.表麵微生物數
擦拭法(棉拭子法)
淋洗法
影印盤法(RODAC法)
2.空氣微生物數
沉降菌法     浮遊菌法
浮遊菌數的測定:采用浮遊菌測定儀。
沉降菌數測定:方法:無菌室及淨化工作台麵消毒擦拭後,打開層流淨化裝置及淨化工作台開關30min,將營養瓊脂平板3個及玫瑰紅鈉瓊脂平板3個(直徑9cm),置淨化工作台左、中、右各1個,開蓋暴露30min後將蓋蓋上,分別放在30-35℃培養箱內培養48h及25-28℃培養箱內培養72h,細菌和真菌平均菌落數小於等於1個為100級。實驗室一旦被汙染,潔淨度達不到要求,可以清洗或更換淨化工作台過濾器,用甲醛或丙二醇、乳酸熏蒸消毒,方法:在支架上放一個燒杯(內裝少許甲醛,8ml/平方米),下麵放一個裝有少許乙醇的乙醇燈,點燃後,關閉門窗,乙醇用盡後燈自滅,甲醛蒸氣充滿無菌室,密閉24h。
缺點:甲醛蒸氣易鏽蝕儀器,對人有刺激,可用氨水噴霧中和,減少對人眼的刺激。
(四)環境監控的評價指標
1.表麵微生物數
1.1需氧嗜溫菌小於5cfu/cm2,合格
1.2需氧嗜溫菌在5~25cfu/cm2之間,需進一步調查
1.3需氧嗜溫菌大於25cfu/cm2,不合格,應立即消毒處理
2.空氣微生物數
沉降菌大於15cfu/板,應暫停工作,進行消毒